灵芝三萜与灵芝多糖抗肿瘤作用及其机制研究进展

　　灵芝三萜与灵芝多糖抗肿瘤作用及其机制研究进展

　　王梦晨，张雪涟，陈向东，兰进，魏菲，罗云*，孙晓波*

　　（中国医学科学院药用植物研究所，北京100193）

　　［摘要］随着人口老龄化程度的加剧，肿瘤患者的发病率和死亡率持续上升。目前肿瘤的治疗方法包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗，然而大部分化疗药物可引起严重的副作用和耐药性。因此中医药治疗作为一种替代疗法可以有效地改善肿瘤患者的临床症状，提高生活质量，抑制或稳定肿瘤的发展，延长患者生存期限。由于中药具有良好的安全性，其抗癌潜力日益受到关注。灵芝是一种药用真菌，在我国有着两千多年的历史，是我国中草药宝库中的一个珍品。迄今为止，有许多研究已经提出了灵芝的抗癌特性。灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、调节免疫、保肝、降血糖血脂、抗动脉粥样硬化、保护心脏、抗衰老等。灵芝的化学成分较为复杂，目前已知含有多糖、三萜类、生物碱、核苷类、氨基酸及各种微量元素，灵芝多糖和三萜类化合物的抗肿瘤机制主要通过诱导细胞凋亡、免疫调节、抗血管生成、阻滞细胞周期等来实现。已广泛应用于肺癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的辅助治疗。该文通过对近年来灵芝三萜和灵芝多糖的生物活性及作用机制的相关文献进行归纳汇总，重点综述其抗肿瘤作用及作用机制，以期为灵芝抗肿瘤的进一步开发利用提供参考和借鉴。

　　［关键词］灵芝三萜；灵芝多糖；抗肿瘤；作用机制

　　灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum或紫芝G.sinense的干燥子实体。随着对灵芝研究的深入，现已分离到多种有效成分，包括三萜类、多糖、核苷、甾体、脂肪酸、生物碱、蛋白质、多肽、氨基酸和无机元素等，在预防和治疗疾病上发挥着重要的作用，其抗肿瘤、免疫调节、保肝、降血糖血脂、抗衰老、抗炎、抗菌、抑制色素沉积、保护心脏、抗雄激素、改善身体虚弱、抗动脉粥样硬化等作用已经得到了验证；同时也可以通过调节血压、血脂和血糖起到预防和治疗心脑血管疾病的作用。灵芝三萜中的四环三萜、五环三萜可以增强机体的抗肿瘤免疫力，并且可以对停止分裂时期（G0期）肿瘤细胞进行单独或联合毒杀。灵芝多糖由多种单糖组成，包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖等，并可通过纸色谱分离。灵芝多糖可使免疫细胞在肿瘤发生早期将其杀死，或提高血小板纤维蛋白的形成能力包裹早期肿瘤肿块，使其长期处于休眠状态。近年来，已有研究证实灵芝三萜和灵芝多糖可抑制肝癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤，本文对灵芝三萜与灵芝多糖类成分抗肿瘤活性及其机制研究进展作一综述。

　　1灵芝三萜与灵芝多糖抗肺癌作用及其机制

　　1.1灵芝三萜抗肺癌作用及其机制ZOLJ等检测了12种浓度的灵芝总三萜处理24，48，120h后肺癌细胞的增殖情况，并检测不同浓度灵芝总三萜处理后细胞凋亡蛋白的含量。结果显示，B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）水平增加了6.5倍，Bax/大分子B淋巴细胞瘤蛋白（Bcl-xl）也相应增加。由此可见，肺癌细胞增殖能力下降与灵芝三萜介导的细胞凋亡有关。

　　LIU等建立了A549肿瘤细胞携带裸鼠模型，以评估灵芝三萜对肿瘤抑制作用。灵芝三萜联合吉非替尼治疗显著降低血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因和蛋白的表达，而生理盐水组血管抑制素和内皮抑制素表达升高。可见，灵芝三萜可以通过抑制肿瘤血管的生成从而产生抗癌作用，同时联合吉非替尼使用可减小不良反应。这一结果为治疗肺癌提供了新的选择。

　　1.2灵芝多糖抗肺癌作用及其机制细胞外信号调节蛋白激酶信号通路（ERK）在细胞增殖、入侵、迁移、分化和凋亡中起着重要的作用，灵芝多糖剂量依赖性地抑制ERK通路相关蛋白的表达和磷酸化，从而诱导细胞凋亡以抑制肺癌细胞的增殖。李志强等研究了灵芝多糖对人肺癌细胞增殖和凋亡的作用，将肺癌细胞分为不同的组分别进行干预，并检测其凋亡和增殖能力的变化。结果显示，高浓度灵芝多糖干预组细胞Bcl-2，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt）相对表达量较低，这说明使用灵芝多糖进行干预，能够抑制肺癌细胞增殖，促进肺癌细胞凋亡。HSU等在灵芝中分离出一种多糖，并通过功能研究得出该多糖可以通过抑制多个细胞内分子，从而抑制细胞的生存活力；并在小鼠肿瘤模型中发现该多糖抑制了肺癌小鼠肿瘤生长和转移，提高了其存活率。ZHU等的研究表明灵芝多糖对免疫器官有明显的保护作用，并且灵芝多糖与顺铂联合治疗可以减轻顺铂引起的免疫抑制和器官损伤，例如明显减轻了顺铂降低T细胞比例的作用。另外，对小鼠进行顺铂治疗后，血清丙氨酸氨基转移酶（AST），天冬氨酸氨基转移酶（ALT）等水平明显升高，提示了急性肝肾功能衰竭的迹象，而灵芝多糖辅助治疗可明显改善。WANG等研究显示，灵芝多糖还具有减轻化疗引起的恶心和呕吐的作用，可以逆转顺铂诱导的摄食量减少，意味着灵芝多糖可以极大地提高癌症患者的生活质量。由此可见，联用灵芝多糖可以明显减轻常规化疗药物的毒副作用，增强常规化疗药物的疗效，这对于灵芝抗肿瘤功效的研究方向有着深远的意义。

　　目前研究显示，淋巴细胞中的穿孔素和颗粒酶B与细胞毒淋巴细胞的功能密切相关，且淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达被肺癌患者抑制，而这种抑制可以被灵芝多糖拮抗，这可能进一步说明肺癌患者血浆可能抑制淋巴细胞功能，而灵芝多糖可以对抗这种抑制，这项研究确定了灵芝多糖在预防肺癌患者血浆引起的淋巴细胞抑制方面的潜力。

　　2灵芝三萜与灵芝多糖抗肝癌作用及其机制

　　2.1灵芝三萜抗肝癌作用及其机制RUAN等研究了在灵芝三萜提取物中分离的6种灵芝三萜对人结直肠腺癌细胞，肝癌细胞和宫颈癌细胞3种癌细胞的作用，发现6种化合物都能够减少3个癌细胞系的生长，对肝癌细胞的细胞损伤作用最为敏感，可能是在肝癌细胞中酵素酶和尿苷5′-二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶高度表达，而这些酶能催化灵芝三萜结合成亲水的葡萄糖醛酸衍生物，使其具有更强的细胞损伤。由此可见，灵芝三萜可通过阻断肝癌细胞周期G0期到DNA合成前期（G1期）的转变，使得细胞周期停滞而抑制肝癌细胞的生长。

　　化疗是肝癌最常见的治疗选择之一，多药耐药性蛋白介导的多药耐药是化疗的主要障碍。LIU等研究灵芝酸B逆转肝癌细胞，对阿霉素、长春新碱和紫杉醇的多药耐药作用。天然来源的多药耐药性蛋白抑制剂通常具有低毒性，灵芝三萜类通过影响药物转运，干扰多药耐药性蛋白的功能，增加阿霉素、长春新碱和紫杉醇的细胞损伤。这种作用可增加细胞内药物积累，逆转多药耐药性蛋白介导的多药耐药，从而抑制肝癌细胞的增殖和转移。

　　2.2灵芝多糖抗肝癌作用及其机制LI等的研究结果表明，灵芝多糖可以显著抑制肝癌小鼠的肿瘤生长，这可能和效应T细胞（Teff）与调节T细胞（Treg）的比值增加有关。灵芝多糖可以消除CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-Teff增殖的抑制，同时增加白细胞介素-2（IL-2）的分泌。在此研究中，作者发现给予灵芝多糖后肝癌小鼠的瘤内因下调了作用靶点，从而显著上调微小RNA-125b（miR-125b）。这些证据表明灵芝多糖通过上调miR-125b的表达来发挥抗肝癌活性。值得注意的是，灵芝多糖对荷瘤小鼠的体质量没有影响，对正常肝细胞株的细胞损伤很小，说明灵芝多糖治疗肝癌是安全的。

　　在治疗癌症的过程中，DNA损伤会降低放疗或化疗药物的效率，从而诱导肿瘤细胞产生耐药性。因此，为了提高电离辐射对癌细胞的敏感性，抑制DNA修复相关酶是一种有效的策略。为了研究灵芝多糖对肝癌细胞中DNA损伤反应的影响，YU等检测了肝癌细胞辐射后，毛细血管扩张性共济失调突变因子重组蛋白（ATM）和DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）的表达。结果表明，灵芝多糖可显著抑制ATM和DNA-PK的磷酸化，可见，灵芝多糖可抑制辐射诱导的DNA修复。Akt信号通路参与了许多与细胞周期调控相关的过程，包括DNA复制和损伤修复。该研究结果还显示灵芝多糖可以显著促进肝癌细胞在辐射条件下的凋亡，这可能是由Akt信号通路介导的。

　　3灵芝三萜与灵芝多糖抗宫颈癌作用及其机制

　　3.1灵芝三萜抗宫颈癌作用及其机制LIU等测定4种灵芝三萜对人类宫颈癌细胞活力的影响，并评估了宫颈癌细胞核形态变化，使用流式细胞仪进行凋亡评估、进行线粒体电位测量、测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3和Caspase-9的活性，并对细胞内活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶进行活性检测。结果表明，灵芝三萜可以通过抑制谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平；诱导活性氧积累，而活性氧的积累可能导致脂质和蛋白质的氧化，使DNA氧化损伤，并破坏线粒体的完整性，促使细胞凋亡。由此可见，活性氧改变了细胞抗氧化物平衡，表明抗氧化防御参与了灵芝三萜引起的细胞损伤。

　　14-3-3蛋白能够调节线粒体生成、调控细胞周期和诱导凋亡。YUE等等通过分子对接分析结果得出，灵芝酸D可以结合14-3-3蛋白家族的6个亚型、膜联蛋白A5和氨肽酶B。此外，灵芝酸D还可以降低细胞内活性氧水平的调节因子过氧化物还原蛋白，从而提高宫颈癌细胞的活性氧水平，从而实现抗宫颈癌作用。这与LIU等用4种灵芝三萜作用于宫颈癌细胞所得到的结果基本一致。

　　3.2灵芝多糖抗宫颈癌作用及其机制KONG等建立了宫颈癌小鼠模型，将小鼠分为4组，分别用以无菌生理盐水、环磷酰胺、灵芝多糖、酶解灵芝多糖，并在14d后收集胸腺、脾脏和肿瘤组织样本并称重，计算肿瘤抑制比。在这项研究中，作者发现灵芝多糖可以保护免疫器官，改善抗氧化酶的活性从而抑制肿瘤生长，抗肿瘤活性强且不良作用小，而环磷酰胺对免疫器官表现出严重的不良反应。灵芝多糖可能通过增加Bax和活化的Caspase-3（cleavedCaspase-3）表达，及减少Bcl-2和环氧化酶-2（COX-2）表达来抑制肿瘤的发展。由此可得，灵芝多糖能够通过调节与细胞凋亡有关基因的表达，来促进肿瘤细胞凋亡。

　　JIN等测量了人类宫颈癌细胞中信号转导和转录激活因子5（STAT5）和Janus激酶（JAK）及其磷酸化水平的表达。发现灵芝多糖显著减少磷酸化STAT5和JAK水平，而STAT5和JAK在宫颈癌细胞中的表达基本不变。由此可以得知，灵芝多糖抑制了宫颈癌细胞的JAK/STAT5信号通路，降低了宫颈癌细胞的生存能力，从而诱导宫颈癌细胞凋亡。

　　4灵芝三萜与灵芝多糖抗前列腺癌作用及其机制

　　4.1灵芝三萜抗前列腺癌作用及其机制王涛用灵芝三萜作用于前列腺癌细胞，进行细胞活性检测，同时检测灵芝三萜对癌细胞凋亡的影响。结果显示前列腺癌细胞呈剂量依赖式抑制生长，灵芝三萜能增加癌细胞在G1/G0，激活细胞凋亡因子Caspases-3和Caspases-9。这说明灵芝三萜主要抑制癌细胞从G1到DNA合成期（S期）的转变过程，同时减少凋亡蛋白而抑制细胞增殖。

　　QU等的研究结果表明，灵芝三萜可降低抗凋亡蛋白的表达，增加促凋亡蛋白的表达水平，通过抑制基质金属蛋白酶的表达，抑制前列腺癌细胞的生长，同时抑制其迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。

　　4.2灵芝多糖抗前列腺癌作用及其机制WU等的数据表明灵芝多糖通过上调非甾体类抗炎药活化基因-1（NAG-1）的转录和下调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号通路激酶（ERK）和Akt信号通路显着抑制前列腺癌细胞增殖。蛋白免疫印迹法（Westernblot）结果显示，灵芝多糖下调了前列腺癌细胞中Caspase-3，Caspase-6，Caspase-9蛋白表达水平。因此，灵芝多糖可能通过诱导前列腺癌细胞凋亡而有效的抑制前列腺癌细胞增殖。ZHAO等的研究表明灵芝多糖抑制了前列腺癌细胞的生长，降低了癌细胞中周期蛋白蛋白质精氨酸甲基转移酶6（PRMT6），细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和黏着斑激酶（FAK）的表达，增加了周期抑制蛋白（p21）的表达。此外，在PRMT6过表达和敲低细胞中，灵芝多糖介导的肿瘤细胞迁移和调节CDK2，FAK和p21蛋白的表达均受到影响。因此，灵芝多糖可能通过PRMT6信号通路抑制了前列腺癌细胞迁移，这表明灵芝多糖作为一种肿瘤抑制剂，具有治疗前列腺癌的潜力。

　　5灵芝三萜与灵芝多糖抗乳腺癌作用及其机制

　　5.1灵芝三萜抗乳腺癌作用及其机制有研究报道，灵芝三萜具有抗乳腺癌的作用，主要机制是增强机体的免疫功能。灵芝酸A是灵芝中研究最多的三萜类化合物之一，能有效抑制乳腺癌细胞增殖和转移。Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路在胚胎发育和组织平衡中起着重要的作用。ZHANG的研究首次证明灵芝可抑制细胞表面的Wnt/β-catenin信号通路，这种活性与其抑制乳腺癌细胞增殖和迁移密切相关。灵芝通过抑制低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的磷酸化，抑制了靶基因轴抑制蛋白2（Axin2）表达，阻止了Wnt/β-catenin信号。由此可见，灵芝联合其他靶向药物可以增强Wnt通路突变乳腺癌的治疗效果。作为一种副作用小的天然产物，具有广阔的发展前景，可以在未来预防甚至治疗功能上进行不断优化。

　　SMINA等评估灵芝总三萜的细胞损伤，结果表明其对乳腺癌细胞具有细胞损伤。通过评估灵芝总三萜对参与细胞凋亡途径的各种蛋白质表达水平，研究乳腺癌细胞凋亡机制，发现灵芝总三萜能改变乳腺癌细胞中细胞周期蛋白D1（cyclinD1），Bcl-2，Bcl-xl，Bax和Caspase-9水平。而Caspase-9的激活可导致其他Caspase的激活，并伴随DNA的断裂，激活癌细胞凋亡反应，抑制致癌物质的活化，这可能是其具有抗乳腺癌活性的原因。

　　5.2灵芝多糖抗乳腺癌作用及其机制灵芝多糖可以加强免疫系统构建，增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。癌细胞通过释放免疫抑制介质对抗监视，而灵芝多糖可抑制细胞增殖和激活分化抗原簇69（CD69）的表达来抵消这种免疫抑制并控制肿瘤形成。

　　SU等的研究进一步探究了灵芝多糖对紫杉醇抗癌活性的促进作用。在小鼠的乳腺癌模型中，与单独使用紫杉醇相比，联合使用灵芝多糖能较早抑制肿瘤生长，对细胞核相关抗原（ki67）蛋白的表达有明显的抑制作用。紫杉醇联合灵芝多糖通过抑制免疫检查点程序性死亡受体-1（PD-1）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim3）的表达，使已经衰竭的抗肿瘤免疫细胞恢复正常。从目前的数据来看，在紫杉醇微管聚合的基础上，添加灵芝多糖的紫杉醇可以在肿瘤微环境内带来有益的改变，从而提高细胞对紫杉醇的敏感性，同时增强抗肿瘤免疫。而且在改变肿瘤免疫的同时，联合灵芝多糖对紫杉醇诱导的肠道菌群失调有恢复作用，不仅重塑了菌群，而且调控了菌群功能。

　　6灵芝三萜与灵芝多糖抗结肠癌作用及其机制

　　6.1灵芝三萜抗结肠癌作用及其机制LI等的研究旨在评价灵芝中性总三萜和酸性总三萜的体内外抗癌作用，探索其对人结直肠癌细胞SW620的抗癌活性成分。采用噻唑蓝（MTT）比色法检测对3种人结肠癌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的不良反应。并在裸鼠体内检测2种灵芝总三萜对SW620的抗肿瘤活性。研究结果显示两种灵芝总三萜均可以降低结直肠癌细胞的体外活力，诱导癌细胞凋亡，在治疗期间显著抑制小鼠结直肠癌细胞的生长，这与促凋亡蛋白cleavedCaspase-3和cleavedCaspase-9的水平上调有关。因此，其抗癌作用机制可能与线粒体依赖性通路的激活有关。

　　6.2灵芝多糖抗结肠癌作用及其机制相关研究观察了酶解灵芝多糖（EGLP）抗结肠癌的作用机制。测定了EGLP对人类结肠直肠腺癌细胞（HCT-116）增殖抑制作用，结果显示EGLP抑制了HCT-116的活力，但并未抑制正常细胞的活力。蛋白结果显示有抑制细胞凋亡作用的Bcl-2，磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（p-ERK）和磷酸化蛋白激酶B1（p-Akt1）蛋白以EGLP剂量依赖的方式减少，而有促进细胞凋亡作用的蛋白Bax以EGLP剂量依赖的方式增加。mRNA结果显示有抑制细胞凋亡作用的Bcl-2和COX-2mRNA表达量以EGLP剂量依赖的方式降低。促进细胞凋亡的Bax和cleavedCaspase-3mRNA表达量以EGLP剂量依赖的方式增加。可见EGLP可能通过调节p-Akt1/p-ERK信号通路和Bax/Bcl-2蛋白质表达抑制结肠癌细胞生长。

　　7其他

　　最新报道显示灵芝酸D能通过诱导自噬性细胞死亡促进两种食管鳞状癌细胞凋亡，表明灵芝三萜类成分可能具有抗食管癌的作用。且灵芝酸表现出对登革热病毒蛋白酶有显著的结合亲和力，表明它们可开发用于登革热病毒感染的抗病毒药物。此外，灵芝三萜已被证实有抗单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2），甲型流感病毒（流感A），水疱性口炎病毒（VSV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）的抗病毒活性。灵芝多糖可通过抑制微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的表达和自噬流，诱导胃癌细胞凋亡。此外，灵芝多糖还能通过调节肠道微生物减少小鼠黑色素瘤的转移。表明灵芝多糖在治疗胃癌和黑色素瘤方面具有潜在的价值。

　　8结论与展望

　　综上所述，灵芝三萜与灵芝多糖抗肿瘤的机制主要是诱导细胞凋亡，包括促进抑癌基因表达、提高促凋亡蛋白水平、阻滞肿瘤细胞周期、诱导DNA损伤、诱导活性氧积累、抑制MAPK/ERK/Akt/JAK/STAT5/PRMT6/Wnt/β-catenin等相关信号传导通路等。见图1。

　　近年来随着对灵芝抗肿瘤的药理作用和作用机制的深入研究，其在抗肿瘤中的应用越来越广泛。目前临床上灵芝主要辅助化药抗肿瘤，但是对于病程周期长的结直肠癌和乳腺癌等，单用灵芝进行早期干预是否能得到很好的疗效需后续深入研究证明。灵芝药效成分主要是灵芝三萜和灵芝多糖。国内外学者对于灵芝三萜和多糖实现抗肿瘤作用的分子调控机制研究主要集中于调节细胞增殖、周期、凋亡、免疫等信号通路及相关蛋白，但其具体作用靶点以及与靶点如何结合有待明确，这影响了其进一步应用。另外，目前的抗肿瘤作用研究主要集中于肿瘤靶细胞，对于肿瘤组织周围细胞（即肿瘤转移）是否具有干预作用还有待阐明；近年来，空间转录组单细胞测序等技术广泛应用于基础研究，可利用该技术分析对灵芝肿瘤及瘤旁组织中各类细胞的影响。因此还需要深入研究，为临床上应用灵芝作为抗肿瘤药物奠定坚实的基础。